黑色素瘤是澳大利亞最危險(xiǎn)的皮膚癌之一，確診后五年內(nèi)死亡率為85%。其在澳大利亞的發(fā)病率不僅是世界上理想的，而且在持續(xù)上升?，F(xiàn)在每年會(huì)診斷出11000例新發(fā)黑色素瘤的病例，預(yù)計(jì)到2020年會(huì)達(dá)到每年15000例。皮膚癌與細(xì)胞代謝異常有關(guān)，如果能在皮膚癌的早期鑒定出來(lái)，可以采取治療措施防止其進(jìn)入致命的轉(zhuǎn)移期。最近的先進(jìn)光學(xué)技術(shù)發(fā)展使得皮膚癌的早期診斷能力大大加強(qiáng)。這樣的早期診斷成像技術(shù)包括反射共聚焦顯微鏡，多光子顯微鏡，光學(xué)相干成像，拉曼光譜和多模式成像技術(shù)。在過(guò)去十年中，熒光壽命成像（FLIM）與多光子顯微鏡聯(lián)用在表征/診斷皮膚疾病，特別是黑素細(xì)胞病變方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。
FLIM是一種獨(dú)特的工具，能夠測(cè)量和區(qū)分單個(gè)細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的游離和蛋白質(zhì)結(jié)合形式的百分比。NADH及其磷酸化形式NADPH是參與細(xì)胞能量產(chǎn)生的天然輔酶。 NADH和NADPH的還原形式的熒光壽命取決于與蛋白質(zhì)的結(jié)合。結(jié)合的NADH壽命在1.2ns至4ns的范圍內(nèi)，未結(jié)合的NADH壽命在約300ps至500ps的范圍內(nèi)。結(jié)合和未結(jié)合的NADH的濃度比取決于代謝的類型：當(dāng)細(xì)胞處于氧化磷酸化狀態(tài)時(shí)，結(jié)合/未結(jié)合比例高于糖酵解狀態(tài)。因此，衰變成分的相對(duì)幅度隨著代謝的類型而變化，平均熒光壽命也隨之變化。由于正常細(xì)胞優(yōu)先運(yùn)行氧化磷酸化，而腫瘤細(xì)胞運(yùn)行糖酵解，熒光衰減參數(shù)的相應(yīng)變化具有區(qū)分健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的潛力。NADH熒光壽命與NADH / FAD氧化還原比值相結(jié)合還可以用于預(yù)測(cè)乳腺癌的藥物反應(yīng)。
由于未結(jié)合的NADH壽命在約300ps至500ps的范圍內(nèi)，我們需要儀器響應(yīng)函數(shù)（IRF）低于這個(gè)熒光壽命范圍的探測(cè)器。Becker&Hickel最近的實(shí)驗(yàn)表明，使用SPC-150N和SPC-150NX TCSPC模塊加上HPM-100-06和-07檢測(cè)器所得到的IRF寬度小于20 ps。 這樣快速的IRF不會(huì)干擾熒光衰減，數(shù)據(jù)分析中通常的反卷積過(guò)程實(shí)際上變成了一個(gè)簡(jiǎn)單的曲線擬合。
可以看到試驗(yàn)中檢測(cè)系統(tǒng)的時(shí)間分辨率非常好。熒光的發(fā)生發(fā)生在不到兩個(gè)時(shí)間通道上，表明IRF的確短于20 ps，這樣顯著提高了NADH FLIM的準(zhǔn)確性。 IRF不再干擾快速熒光成分的衰變時(shí)間。
來(lái)自昆士蘭大學(xué)的研究者同樣結(jié)合多光子顯微鏡與FLIM利用細(xì)胞內(nèi)自發(fā)熒光來(lái)監(jiān)測(cè)代謝輔酶NADH的游離和蛋白結(jié)合形式的量的比例的成像。他們使用同基因黑色素瘤小鼠模型檢測(cè)單一表皮細(xì)胞代謝狀態(tài)的變化，作為監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展的代謝標(biāo)記。通過(guò)三個(gè)不同的黑色素瘤病變生長(zhǎng)階段與正常的皮膚進(jìn)行對(duì)比，他們發(fā)現(xiàn)隨著固體黑素瘤腫瘤的生長(zhǎng)自由結(jié)合的NADH比率顯著增加，同時(shí)NADH的短壽命和長(zhǎng)壽命組分保持不變。這些結(jié)果表明FLIM能夠快速，非侵入性和敏感地評(píng)估黑色素瘤進(jìn)展，揭示其作為黑色素瘤檢測(cè)診斷工具的潛力，并作為黑色素瘤分期的輔助手段。
上圖：不同小鼠黑色素瘤階段的NADH的游離和蛋白結(jié)合形式的比率以及熒光壽命。
德國(guó)Becker&Hickl GmbH公司，時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)的優(yōu)秀廠商，成立于1993年，從創(chuàng)立之初便推出了革命性的時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器，速度比傳統(tǒng)的TCSPC技術(shù)快了上百倍。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，在用戶實(shí)驗(yàn)需求的推動(dòng)下，B&H公司提供了多維TCSPC技術(shù)，能夠在短暫的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到多維光子分布信息，如時(shí)間、波長(zhǎng)、空間坐標(biāo)、熒光壽命等等。在生命科學(xué)領(lǐng)域成功與各大顯微鏡公司合作，提供基于共聚焦顯微鏡的熒光壽命成像系統(tǒng)（FLIM）。另外，B&H公司也擁有自主開(kāi)發(fā)的共聚焦顯微FLIM系統(tǒng)，而且能夠提供皮秒激光器、探測(cè)器及相關(guān)實(shí)驗(yàn)控制模塊，產(chǎn)品種類豐富，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，極其適用單光子探測(cè)，熒光壽命成像等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
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